Control integral de la Enfermedad de Marek desde la planta de incubación

17 octubre, 2020

La vacunación con MD aplicada a embriones de 18.5 días o a pollitos recién nacidos, permite controlar la enfermedad, logrando una óptima inmunidad. Las vacunas MD para el control de la Enfermedad de Marek son únicas porque están asociadas a células y requieren un cuidado especial durante su desarrollo, manejo, almacenamiento y aplicación para tener […]

La vacunación con MD aplicada a embriones de 18.5 días o a pollitos recién nacidos, permite controlar la enfermedad, logrando una óptima inmunidad.

Las vacunas MD para el control de la Enfermedad de Marek son únicas porque están asociadas a células y requieren un cuidado especial durante su desarrollo, manejo, almacenamiento y aplicación para tener éxito. La naturaleza de células asociadas de las vacunas MD las hace muy lábiles. Es imperativo que las células estén vivas para que el virus de la vacuna pueda replicarse en el ave. Hay muchos factores que pueden afectar la viabilidad celular. Es importante recordar que las vacunas son suspensiones inestables de células que tienden a flocular y precipitarse. Además, no todas las células de la vacuna están infectadas, solo un pequeño porcentaje. Por lo tanto, es crítico que las vacunas se mezclen adecuadamente en el diluyente antes y durante la vacunación.

Es de extrema importancia supervisar el proceso de reconstitución y aplicación de estas vacunas. Al vacunar en la planta de incubación a los embriones de 18-19 días de incubación, mediante la aplicación in ovo, como al día de vida por inyección subcutánea, la supervisión del proceso se hace mucho más sencilla: el procedimiento de vacunación se controla mejor y se utilizan equipos de vacunación más sofisticados y precisos tanto en la dosificación como en la distribución de la vacuna, mejores condiciones higiénicas en la preparación y reconstitución de la vacuna, y una inmunización más temprana .

Para lograr una vacunación e inmunización eficientes para el control integral de la enfermedad de Marek, hay que controlar de manera exhaustiva los siguientes puntos críticos en la planta de incubación:

1.- Ruptura de la cadena de frío en nitrógeno líquido: como las vacunas que protegen contra la EM son vacunas asociadas a células, para que éstas puedan conservarse vivas, deben estar almacenadas a -196 °C, sumergidas en nitrógeno líquido. Si el vial de la vacuna se descongela durante el transporte y/o el almacenaje, las células mueren y el virus vacunal no podrá replicarse en el ave. Es muy importante que la vacuna esté cubierta con nitrógeno líquido (verificar regularmente y tener registros) y almacenar los viales invertidos en el tanque de nitrógeno líquido para detectar un posible descongelamiento. 

2 . Reconstitución de la vacuna: las vacunas asociadas a células deben reconstituirse siguiendo un protocolo estricto para no dañar las células y que el virus vacunal pueda replicarse dentro del ave. Los puntos críticos que puedan dañar las células dentro del protocolo de reconstitución de vacunas son:

 2.1.- Descongelamiento incorrecto en el baño María: si el vial de la vacuna no se descongela en un baño María a 26-28ºC durante 60-90 segundos y se reconstituye inmediatamente con el diluyente, las células comienzan a morir y los títulos caen. Las vacunas se mantienen congeladas en nitrógeno líquido. Para preservar las células vivas durante el proceso de congelación, es necesario agregar el químico dimetil sulfóxido (DMSO), el cual evita que se formen cristales dentro de las células. Sin embargo, mientras el DMSO preserva la viabilidad celular al estar congelado, es extremadamente tóxico a temperatura ambiente. Para evitar que el DMSO mate las células, es fundamental que los viales se descongelen en un baño María a 26-28ºC durante 60 a 90 segundos y la vacuna se reconstituya inmediatamente en el diluyente. Cualquier falla en este proceso, provocará la muerte celular y, por lo tanto, los títulos de las vacunas disminuirán.

Figura 3 – Descongelado de las ampollas en baño maría.

2.2.- Calibre incorrecto de la aguja: si el calibre de la aguja es demasiado pequeño, las células se dañan y mueren, y los títulos de la vacuna caen . Se recomienda utilizar agujas 18 G x 1.5 pulgadas.

2.3.- Extraer la vacuna con carga previa de diluyente: previamente a retirar la vacuna, se aconseja cargar 3 ml de diluyente en la jeringa para que, al retirar el contenido del vial, tenga contacto directamente con el diluyente y no extraerla en “seco” (jeringa sin carga) ya que esto puede afectar la viabilidad de la vacuna.

2.4.- Retirar la vacuna del vial y colocarla en el diluyente de manera suave: si el proceso se realiza de manera brusca aumentará la presión en el interior del embolo de la jeringa y se puede ver afectada la viabilidad celular. Realizar este procedimiento de manera suave, moviendo lentamente el embolo de la jeringa. Es importante también, realizar un enjuague de la cabeza y cuerpo de la ampolla con diluyente para asegurar que toda la vacuna se haya transferido al diluyente.

Figura 4 – Extracción de la vacuna con carga previa de diluyente

3.- Adición de aditivos (antibióticos, prebióticos, probióticos): no se recomienda adicionar ningún aditivo a la vacuna contra la enfermedad de Marek, ya que se ha demostrado que varios de ellos reducen los títulos de las vacunas. Consulte al fabricante de la vacuna antes de añadir cualquiera de estos aditivos. Se ha demostrado que algunos antibióticos como la gentamicina reducen los títulos de vacunas. El efecto negativo de la gentamicina en los títulos de las vacunas no se reduce ajustando el pH. Se cree que la gentamicina podría afectar la capacidad del virus para propagarse de una célula a otra . Se ha informado que otros antibióticos como el Ceftiofur son seguros para las vacunas MD. Sin embargo, es muy importante evitar agregar antibióticos y otros aditivos a las vacunas MD a menos que esté bien estudiado que no tienen ningún efecto en los títulos. Como se observa en el gráfico, si analizamos la disminución en los PFU, la caída de los títulos vacunales es aún mayor (Eidson, C. S., Page, R. K. & Kleven, S. H. In vivo and in vitro studies on the effect of gentamicin sulfate on the efficacy of the turkey herpesvirus vaccine. Poult.Sci.57, 1519-1525 (1978))

4. Mezclado incorrecto del diluyente: si la vacuna no se mezcla correctamente, existirá mucha variabilidad en la dosis de vacuna que los pollos reciben a partir de la misma bolsa. Puede ser que algunos no reciban la dosis protectora necesaria. La naturaleza asociada a las células de las vacunas MD las hace suspensiones inestables y las células tienden a fusionarse y precipitarse. Además, el porcentaje de células infectadas con el virus de la vacuna en cada vial es variable, pero tiende a ser inferior al 20%. Cuando se usa la vacuna a la dosis recomendada y bien homogenizada, la mayoría de los pollos recibirán al menos la dosis de vacuna protectora . Si no se mezcla correctamente, algunos pollitos podrían no recibir la dosis protectora mínima necesaria para esa vacuna.

5. Usar una vacuna reconstituida por demasiado tiempo: las células comienzan a morir una vez que la vacuna se reconstituye. Idealmente, la vacuna deberá usarse en un período de tiempo de 30 a 40 minutos (máximo 60 minutos). Un uso mayor de la vacuna reconstituida rendirá menos títulos y aumentará la variabilidad de la dosis de la vacuna.

6. Mezclar la vacuna durante la administración: Mezcle la vacuna frecuentemente (por lo menos cada 10 a 15 minutos). Las células tienden a precipitarse y necesitan ser suspendidas.

7. Utilizar dosis recomendada: nunca se debe utilizar menos de la dosis recomendada, media dosis, cuarto de dosis, etc. La dilución excesiva de la vacuna para reducir los costos de vacunación es frecuente, especialmente en las explotaciones de pollos de engorde. Nunca se recomienda diluir las vacunas, ya que esto reduce la dosis recomendada y afectará negativamente la protección contra la EM y, en el caso de las vacunas recombinantes, también contra el inserto.

8. Administración de la vacuna: así como fueron evolucionando las vacunas para una mejor protección contra la enfermedad de Marek, la manera de administrar la vacuna y el proceso de vacunación también fue mejorando con el pasar de los años. En un principio se utilizaban jeringas manuales, luego equipos neumáticos semiautomáticos y finalmente la vacunación in ovo. En los dos primeros la vacuna es inoculada de manera subcutánea a los pollitos bebé de un día en la parte media del cuello. En la vacunación in ovo la vacuna es administrada en el líquido amniótico o intra-embrión. Independientemente de la vía, es muy importante monitorear los procesos de vacunación.

8.1. Vacunación subcutánea: los equipos subcutáneos administran 0.2 ml a cada pollito de manera subcutánea en la parte media del cuello. Hay que monitorear que la máquina esté dispensando la dosis correcta en todo momento. Para ello se utilizan probetas graduadas donde se realizan 50 disparos y se mide el volumen obtenido que debe ser de 10 ml, de no ser así debe ajustarse de inmediato.

La eficiencia de vacunación debe ser controlada por vacunador para identificar y corregir posibles desvíos. Debemos buscar una eficiencia de vacunación superior al 98%. Los errores más comunes son pollitos con el plumón húmedo, traumatizados, con la vacuna en mala posición o pollitos sin vacuna. En muchas plantas de incubación se observan porcentajes inferiores al 90%. Pollito mal vacunado no tendrá la inmunidad adecuada. El tipo de máquina vacunadora y la presión de trabajo pueden afectar de manera drástica la viabilidad celular de la vacuna. No se recomienda trabajar a más de 4 bares de presión y monitorear si la máquina daña las células mediante un análisis de viabilidad celular.

El gráfico 4 muestra tres ejemplos de plantas de incubación donde se observaron problemas respecto al tipo de máquina vacunadora subcutánea. Los datos muestran la proporción de células vivas de la vacuna con problemas en relación a la vacuna testigo (misma serie). La cantidad de células viables fue determinada mediante la técnica de celometría digital computarizada de doble fluorescencia. Se observa cómo en todos los casos el porcentaje de disminución de células vivas fue estadísticamente significativo, p<0,05 (69 %, 71 % y 79 % respectivamente). Al reemplazar las máquinas problema por vacunadoras en condiciones normales el problema dejaba de expresarse.

8.2. Vacunación in ovo: la vacuna MD se puede administrar a los embriones entre los 18 y 19 días de edad, entregando 0.05 ml a cada embrión. La administración de la vacuna en el embrión se realizará por vía amniótica mayoritariamente cuando se vacuna entre los 18 y 18,5 días de edad de desarrollo embrionario y principalmente vía intra embrionaria a los 19 días. La mayoría de las incubadoras administran la vacuna a los 18,5 días de desarrollo embrionario, cuando se lleva a cabo la transferencia de los huevos a las máquinas de la incubadora. La vacunación in ovo no solo permite que la vacuna tenga 2 a 3 días más para replicarse, sino que también acelera la maduración del sistema inmune de los embriones. Es de extrema importancia realizar una auditoría integral de la vacunación in ovo para el éxito de la misma. Los principales puntos a controlar son: determinar la edad fisiológica de los embriones; determinar el sitio de inyección, determinar el volumen dosificado por la máquina; porcentaje de huevos invertidos; porcentaje de agujas bloqueadas o parcialmente bloqueadas; porcentaje de agujas dobladas; porcentaje de rotura de huevos en la vacunación / transferencia; porcentaje de inyecciones descentradas.

9. Determinación del porcentaje de viabilidad celular: es muy importante realizar un monitoreo de la viabilidad celular luego de reconstituir la vacuna, durante el tiempo que se utilice y una vez que pase, ya sea, por la máquina in ovo o subcutánea. Una técnica muy difundida es la utilización del microscopio óptico y azul de tripán. Se colocan partes iguales de la vacuna y del colorante, se homogeniza y se coloca el contenido en una cama de Newbauer. Se realiza el conteo de las células vivas y muertas y se calcula el porcentaje de viabilidad celular. Si bien esta técnica se puede utilizar, la misma lleva su tiempo, se limita a un bajo volumen de muestra, no puede realizarse con antibióticos como la gentamicina y no es del todo objetiva, depende de quien la realice el porcentaje de viabilidad celular que obtenga. Para poder resolver estas falencias, se utiliza la celometría digital computarizada de doble fluorescencia, “Cellometer”. La técnica consiste en mezclar partes iguales de vacuna y un reactivo especial, luego se colocan en una cámara específica descartable y ésta dentro del aparato. El mismo se conecta a una computadora y calcula de manera objetiva el porcentaje de viabilidad celular de las muestras. El tamaño muestreal es 240 veces mayor a la técnica de azul de tripán y es posible realizar con antibióticos como la gentamicina.

Figura 5.
Foto del Cellometer. Se observa la fluorescencia con naranja de acridina de los fibroblastos de la vacuna de HVT.

Al utilizar la Cellometer® con doble fluorescencia, si las células están muertas, sus membranas celulares están afectadas, ingresa el ioduro de propidio, se asocia al núcleo celular y fluorece en campo oscuro. Las células vivas fluorecen con el naranja de acridina que es permeable a la membrana celular.

Figura 6
Foto del Cellometer X4, las células que emiten fluorescencia (color verde), son las células muertas, ya que en su ADN esta adherido el ioduro de propidio.

Al contar con esta herramienta podemos cuantificar, en la misma planta de incubación, el almacenaje de la vacuna, la preparación de la misma y la administración a través del equipo subcutáneo o in ovo. Obteniendo en cada caso el porcentaje de viabilidad celular de la vacuna administrada.

Conclusión

La enfermedad de Marek puede controlarse desde la planta de incubación teniendo en cuenta todos los aspectos mencionados y realizando un exhaustivo control de todos los procesos de vacunación. Siguiendo siempre los protocolos recomendados por los laboratorios y teniendo capacitado a todo el personal involucrado en los procesos de vacunación. El desvío en los puntos señalados nos alejará de una óptima vacunación, lo que desencadenará en una inmunidad reducida y en una falla en el control eficiente de la enfermedad de Marek.

Por: Ing. Zootecnista Santiago Cura, Servicios de Vacunación Ceva Salud Animal.
Foto: Ceva
Más información:
https://www.ceva.com.ar/
Fuente: Revista Solo Aves & Porcinos Nº 86